Florentinen ylimyssukuun kuuluva Ezio haluaa kostaa sukunsa puolesta, sillä Italian rappeutuneet mahtisuvut ovat lianneet sen nimen. Löydettyään kappaleen muinaista kirjoitusta hänessä herää toivo. Hän ottaa tehtäväkseen assassiinien veljeskunnan herättämisen uudelleen henkiin.
Seuraavien vuosien kuluessa hän hankkii ystäviä ja vihollisia renesanssikauden Italian vaarallisimpien hahmojen joukosta ja huomaa, että temppeliritarikuntaa ei tuhottukaan, vaikka historia väittää toista.
Temppeliritarit suunnittelevat edelleen maailman ottamista haltuunsa. Hänen on opittava kaikki assassiinien taidot estääkseen temppeliritareita sammuttamasta valistuksen liekkiä. Jos hän epäonnistuu, maailmaan palaa pimeä keskiaika. Hän huomaa myös, että kirjoituksen löytyminen ei ollut sattumaa vaan osa paljon laajempaa suunnitelmaa, joka ulottuu aina nykyaikaan saakka.
